وی حتی به خاطر بازی سینمایی اش برای مدتی از کار تئاتر اخراج گشت. در واقع کار حرفه ای خود را از سال ۱۳۴۹ به طور رسمی شروع کرد. بازی جمشید مشایخی در نقش انسان های بی رحم و همچنین نقش های تاریخی همچون «شازده احتجاب»، «کمال الملک» و رضا تفنگچی/خوشنویس در سریال «هزار دستان» نشانگر اهنر ایشان است. او در سال ۱۳۶۳، بابت بازی در دو فیلم گل های داوودی و کمال الملک، برندهٔ سیمرغ بلورین بهترین بازیگدر داخل ایران شد. از نمایش های مهم او بازی در نقش «بزرگ آقا» در نمایش میراث کارِ بهرام بیضایی در تالار ۲۵ شهریور در آذر ماه ۱۳۴۶ بود.

مشایخی در سال ۹۳ به عنوان سفیر سلامت چشم و بینایی و در سال ۹۴ به عنوان سفیر سلامت از سوی وزارت بهداشت و دانشکگاه دکتری دانشگاه تهران معرفی و به وی تندیس سلامت اهدا شد.
مرگ

او پس از تحمل یک دوره بیماری در ۱۳ فروردین ۱۳۹۸ در سن ۸۴ سالگی در بیمارستان عرفان مرد.

در ساعت ۲۱:۰۰ روز ۱۳ فروردین ۱۳۹۸ صفحهٔ اینستاگرام جمشید مشایخی که توسط فرزندانش اداره می شود، در پیامی کوتاه نوشت: «پدر ما ساعت ۹ شب امشب ۱۳/فروردین/۱۳۹۸ در نهایت آرامش رفت پیش خدا جون. تشکر ویژه از همهٔ عزیزانی که همواره به ایشان لطف و محبت می کردند. روح ایشان شاد و یادش گرامی باد. نادر، نغمه و سام درخشانی.»